Zygmunt Pejsak
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Diagnostyczne badania laboratoryjne – narzędzie nieodzowne w zwalczaniu

zakaźnych i niezakaźnych chorób świń

Diagnostyka laboratoryjna jest niezwykle ważnym i przydatnym w praktyce narzędziem w zwalczaniu chorób zwierząt, w tym chorób świń. Niestety z wielu powodów lekarze weterynarii oraz hodowcy zwierząt w znacznej swojej części nie doceniają znaczenia i przydatności badań laboratoryjnych w rozpoznawaniu przyczyn zachorowań oraz opracowywaniu strategii ich zwalczania. Zarówno w odniesieniu do chorób niezakaźnych, jak i zakaźnych weterynaryjna diagnostyka laboratoryjna jest podstawą ich skutecznego zwalczania.

Należy podkreślić, że badania laboratoryjne mają znaczenie nie tylko w ograniczaniu strat w produkcji zwierzęcej, w tym trzody chlewnej, ale też ze względu na identyfikowanie w wymienionym rezerwuarze chorobotwórczych drobnoustrojów oraz określanie ich lekowrażliwości, co zostanie przedstawione oddzielnie.

Niniejszy artykuł poświęcony zostanie zasadom wykorzystywania badań laboratoryjnych w rozpoznawaniu chorób zakaźnych.

Obserwowany, szczególnie w okresie ostatnich 40 lat ogromny postęp w obszarach: biochemii, bakteriologii, wirusologii, immunologii, biologii molekularnej i genetyki doprowadził do niebywałego postępu w zakresie sprawności metod diagnostycznych (swoistość, czułość) oraz szybkości ich wykonania i kosztochłonności. Aktualnie dysponujemy niezwykle zróżnicowanymi metodami rozpoznawczymi przeznaczonymi do wykrywania patogenów bakteryjnych, wirusowych czy pasożytniczych (tabele: 1, 2 i 3).

Wydaje się, że jedną z przyczyn ciągle ograniczonego w naszym kraju zainteresowania części lekarzy weterynarii praktyków diagnostyką laboratoryjną jest brak stałego dialogu między specjalistami z laboratoriów a praktykami. Ważnymi czynnikami w omawianym zakresie były w przeszłości także: ograniczony zakres usług oferowanych przez niektóre laboratoria, a z drugiej, niepełna wiedza praktyków w zakresie interpretacji wyników badań.

Tabela 1. Wykrywanie patogenów, ich antygenów lub swoistych przeciwciał

Tabela 2. Wykrywanie kwasu nukleinowego czynnika patogennego

Tabela 3. Badania serologiczne – wykrywanie przeciwciał w surowicy

Wykorzystywanie diagnostyki laboratoryjnej

Diagnostyka laboratoryjna jest szczególnie przydatna w rozpoznawaniu chorób i zespołów chorobowych oraz infekcji o etiologii wieloczynnikowej, które aktualnie dominują. Jest ona również istotna w wykrywaniu chorób o przebiegu nietypowym lub podklinicznym.

W przypadku chorób zakaźnych wywołanych wyłącznie przez jeden czynnik etiologiczny, charakteryzujących się ogólnym zakażeniem, czyli posocznicą (septicaemia) przy występowaniu dość często nietypowych objawów klinicznych i zmian sekcyjnych, w pełni trafne i szybkie ich rozpoznanie wymaga wykorzystania określonych laboratoryjnych testów diagnostycznych.

Ważną i najczęściej występującą obecnie u świń grupę chorób, nazywanych zespołami lub syndromami chorobowymi, stanowią infekcje o etiologii wieloczynnikowej. Są to choroby o etiologii charakteryzującej się udziałem kilku drobnoustrojów, spośród których z reguły jeden gatunek inicjuje zachorowanie. Ważną rolę w ujawnianiu się tych chorób odgrywają warunki środowiskowe. Przeprowadzone kilka lat temu w Polsce badania uwidoczniły w sposób pośredni (obecność przeciwciał) lub bezpośredni (izolacja czynnika patogennego), że krajowe stada świń z reguły zainfekowane są co najmniej dwoma różnymi czynnikami patogennymi. W ponad 60% stad stwierdzono jednoczesne występowanie co najmniej 4 różnych patogenów; najczęściej cirkowirusa świń (PCV2), wirusów grypy świń (SIV), Mycoplasma hyopnemumoniae (MhP) i Actinobacillus pleuropneumoniae (App).

Znane są też infekcje, które mają niekiedy przebieg podkliniczny (np. salmonelloza świń). W takich przypadkach badanie laboratoryjne jest wyłączną podstawą identyfikowania i eliminowania tego rodzaju rezerwuarów zakażenia. W efekcie przeciwdziała to szerzeniu się infekcji do stad świń wolnych od tego patogenu.

Metody badań laboratoryjnych, którymi dysponujemy umożliwiają odpowiedź nie tylko na pytanie, czy chlewnia zakażona jest takim czy innym czynnikiem patogennym (badanie jakościowe), ale także na pytanie, jaka jest intensywność zakażania stada (badanie ilościowe) oraz jaka jest lekowrażliwość wykrywanych drobnoustrojów bakteryjnych.

            Diagnostyczne badania ilościowe odgrywają rolę przy wykrywaniu przyczyn zespołów chorobowych wywołanych przez drobnoustroje występujące ubikwitarnie (drobnoustroje wszędobylskie) – np. cirkowirusy świń (PCV2). W tym przypadku o uznaniu PCV2 za przyczynę zachorowań świń decyduje nie sam fakt wykrycia PCV2, ale dowiedzenie obecności dużej ilości tego wirusa w badanych węzłach chłonnych.

Badania serologiczne

Próby diagnostyczne, w których istotnym czynnikiem są przeciwciała swoiste dla czynnika wywołującego chorobę wskazują przede wszystkim na fakt kontaktu zwierzęcia z danym patogenem. Umożliwiają także jakościową ocenę towarzyszącej zakażeniu odpowiedzi immunologicznej, dostarczając informacje niezbędne do wnioskowania o przebiegu infekcji.

            Istnieją dwa rodzaje wyników ilościowych testów serologicznych. Pierwszy, jak seroneutralizacja (SN), wyraża się końcowym rozcieńczeniem lub mianem przeciwciał. W drugim, jak np. test immunoenzymatyczny ELISA, określeniem ilości przeciwciał w badanej próbce (odpowiednika miana surowicy przy zastosowaniu innych testów serologicznych, np. odczynu aglutynacji). Powyższego dokonuje się przez porównanie gęstości optycznej, czyli OD (optical density) surowicy badanej z OD surowicy standardowej (czyli surowicy kontrolnej dodatniej o progowym jednoznacznie dodatnim stężeniu przeciwciał). W tym celu dzieli się wartość OD surowicy badanej, czyli pobranej do badania próbki (S, ang. sample, czyli próbka) przez wartość OD surowicy kontrolnej dodatniej zestawu (P, czyli ang. positive = dodatni). Otrzymana liczba charakteryzująca stosunek S/P określa ilość przeciwciał obecnych w surowicy badanej. Wartości S/P niższe od ustalonej wartości progowej (np. 0,4) uznawane są jako wyniki ujemne. Nie oznacza to, że surowica, dla której w teście ELISA uzyskano wartość S/P niższą niż 0,4 nie zawiera przeciwciał. Mogą być one obecne, jednak ich poziom znajduje się poniżej założonego progu czułości danego testu diagnostycznego.

Wynik badania serologicznego może też zależeć od: dawki zakaźnej, trwania infekcji, przebiegu klinicznego, od tego, czy choroba ma charakter systemowy czy miejscowy lub też stanowi wynik infekcji mieszanej. Pewien wpływ na powyższe może mieć wiek, względnie kondycja zwierzęcia. Na poziom odpowiedzi immunologicznej wpływ może też mieć inna infekcja oraz szczepienie przeciw tej infekcji lub innym chorobom zakaźnym, co łączy się z tzw. negatywną fazą odporności. Należy pamiętać, że tego rodzaju dodatkowe czynniki mogą prowadzić do fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych wyników serologicznych, co jednak nie dewaluuje wartości badań serologicznych w diagnostyce chorób zakaźnych.

      Istnieją tkwiące w laboratorium przyczyny różnic w wynikach badań serologicznych tej samej próbki surowicy. Odnoszą się do sprawności pracujących wykonawców technicznych, jak również odczytujących wyniki. W grę wchodzi też różna jakość zestawów diagnostycznych, a nawet poszczególnych odczynników.

Trafność prowadzonych badań laboratoryjnych zależy nie tylko od zastosowanej techniki badawczej i prawidłowości wykonania testu, ale także od właściwego pobrania i przekazania do laboratorium materiału do badań. Należy podkreślić, że niezwykle ważne znaczenie odgrywa liczba pobranych i badanych próbek. Dla przykładu mało przydatne, a często wprowadzające w błąd jest badanie serologiczne techniką ELISA próbek pojedynczych. Wspomniany test uznaje się za tak zwany test stadny, a nie test przeznaczonych do badań pojedynczych osobników.

Fałszywe wyniki badań laboratoryjnych

Należy zdawać sobie sprawę, że z różnych powodów w badaniach laboratoryjnych mogą pojawić się wyniki fałszywie dodatnie lub też rezultaty fałszywie ujemne.

Istnieją cztery wzajemnie wykluczające się kategorie wyników:

1. rzeczywiście pozytywne wyniki (dodatnie w teście z próbką od świń rzeczywiście zakażonych),

2. fałszywie negatywne (ujemne w teście z próbką od świń rzeczywiście zakażonych),

3. fałszywie pozytywne (dodatnie w teście z próbką od świń niezakażonych),

4. rzeczywiście negatywne (ujemne w teście z próbką od niezakażonych świń).

Czułość i swoistość metod badawczych

Ważnymi cechami każdego testu diagnostycznego są czułość i swoistość. Inna jest definicja czułości testu wykonywanego w celu rozpoznania choroby zakaźnej oraz dla celów epidemiologicznych, a czułości testu stosowanego w analityce. W pierwszym przypadku chodzi o wykrycie możliwie dużej liczby zwierząt danego stada rzeczywiście pozytywnych. W drugim przypadku, czyli badań analitycznych, określenie „czułość” dotyczy wykrywania za pomocą testu: występującej w próbce najmniejszej liczby bakterii lub najmniejszej ilości DNA, toksyny względnie przeciwciała. Immunologicznie bardziej czuły test (ELISA w porównaniu z SN) wykrywa zatem przeciwciała wcześniej w trakcie procesu infekcyjnego u indywidualnej świni. W diagnozie stada, w którym częstość występowania zwierząt zakażonych jest średnia do wysokiej, a świnie są w różnych stadiach infekcji – potrzeba wysokiej czułości testu nie musi być szczególnie duża dla sformułowania rozpoznania, że w stadzie występują świnie zakażone. Taki wynik odnosi się do wchodzącego w grę stada, a nie wyłącznie do jednego lub kilkunastu zbadanych osobników.

Test polimeryzacji łańcuchowej (PCR) zastosowany do identyfikacji Mycoplasma (M.) hyopneumoniae ma zdolność wykrywania do 400 drobnoustrojów w jednej próbce. Jeżeli badana jest próbka z tchawiczo-oskrzelowej popłuczyny, to PCR prawidłowo wykrywa ponad 80% eksperymentalnie zakażonych wymienionym drobnoustrojem świń.

            Pojęcie swoistości odnosi się do testu, który poprawnie identyfikuje niezakażone świnie jako rzeczywiście negatywne, a zakażone jako rzeczywiście pozytywne. Test z 90%-ową swoistością prawidłowo klasyfikuje 90% niezakażonych świń jako negatywne i 10% świń jako zakażone (fałszywie pozytywne).

            Fałszywie pozytywny wynik może być związany z podobieństwem antygenowym lub innymi właściwościami (np. DNA) czynnika wywołującego chorobę i innych gatunków drobnoustrojów wywołujących inne choroby niż ta, o którą chodzi. Niejednokrotnie badając próbki z migdałków świń przy użyciu PCR w kierunku Actinobacillus pleuropneumoniae (App) uzyskiwano, obok wyników trafnych, również fałszywie dodatnie wskazujące na występowanie A. suis, A. minor, A. equuli, A. lignieresi, A. porcitonsillarum, Streptococcus suis i Haemophilus parasuis. Na podstawie badań wykonywanych w swoim czasie, między innymi w Instytucie Weterynarii w Puławach, można wręcz stwierdzić, że ze względu na obecność w migdałkach wielu różnych patogenów, co jest zjawiskiem typowym, ten materiał biologiczny nie nadaje się do badań w kierunku App. Badając zeskrobiny z migdałków w kierunku App testem PCR otrzymywano zawsze wyniki ujemne. Badając zaś płuca tych samych świń w tym samym kierunku w około 50% uzyskiwano rezultaty dodatnie. Powyższe wskazuje jak ważny z omawianego punktu widzenia jest dobór materiału do badań.

Niewdzięcznym materiałem do badań serologicznych w kierunku brucelozy świń jest surowica krwi. Nierzadko próby dają wynik dodatni w kierunku brucelozy, czego przyczyną w niektórych przypadkach może być Yersinia spp., a nie brucelle.

Strategia DIVA

W zwalczaniu wielu chorób zakaźnych niezwykle ważną, z epidemiologicznego punktu widzenia, rolę odgrywa możliwość serologicznego odróżnienia zwierząt szczepionych od zakażonych. W tym celu opracowane zostały testy, które umożliwiają odróżnienie przeciwciał indukowanych w organizmie immunizowanego zwierzęcia przez wirus szczepionkowy specjalnie w tym celu genetycznie modyfikowany od przeciwciał wytworzonych pod wpływem terenowego wirusa zjadliwego. Powyższe określane jest jako strategia DIVA (Differentiation of Infected from Vaccinated Animals). Wykorzystywanie strategii DIVA umożliwia prowadzenie szczepień, które z reguły zasadniczo ograniczają siewstwo wirusa i ilość wirusa w stadzie oraz eliminację zwierząt zainfekowanych. Osobniki zainfekowane szczepem terenowym można serologicznie odróżnić od niezakażonych, ale szczepionych. Można też odróżnić świnie szczepione i mimo to zakażone od zwierząt niezainfekowanych. Dzięki temu można ze stada szczepionego eliminować stopniowo wszystkie zwierzęta zakażone i pozostawiać w nim tylko osobniki zaszczepione i niezainfekowane. Technikę DIVA z powodzeniem wykorzystuje się między innymi w zwalczaniu choroby Aujeszkyego. Możliwe jest wykorzystanie tej metody także w przypadku zwalczania klasycznego pomoru świń. U bydła metodę tę wykorzystuje się w zwalczaniu IBR-IPV i BVD – MD.

Diagnostyka laboratoryjna chorób wywołanych przez drobnoustroje warunkowo chorobotwórcze

Choroby świń wywołane przez warunkowo chorobotwórcze drobnoustroje, np. kolibakteriozę, a w tym chorobę obrzękową, stanowią pewien problem w diagnostyce laboratoryjnej w tym sensie, że 100% zwierząt w stadzie może być ich nosicielami np. szczepu Escherichia coli serogrupy 0138 lub 0139, a mimo to żadne zwierzę nie zachorowuje w jednym przypadku. W drugim, identycznym w sensie nosicielstwa takich drobnoustrojów, zachorowuje na kolibakteriozę świń, w tym na chorobę obrzękową, znaczny ich odsetek. Trudno wtedy mówić o czułości i swoistości testu, który wykrywać może wszystkie zwierzęta zakażone, a mimo to nie ma to znaczenia w aspekcie wystąpienia choroby.

Ograniczenia diagnostyki laboratoryjnej

Negatywny wynik badania próbek niekoniecznie wyklucza obecność patogenu jako przyczyny choroby. Ma to miejsce zwłaszcza wtedy, kiedy zastosowany test cechuje się niskiego stopnia czułością i swoistością. Fałszywie ujemne wyniki, jak niewykazanie czynnika wirusowego lub bakteryjnego, mimo że występuje w organizmie świni, mogą mieć miejsce z różnych powodów. Są nimi nierównomierna koncentracja, a nawet brak w badanych próbkach czynnika chorobowego. Długi okres trwania choroby może prowadzić do zmniejszenia ilości bakterii lub wirusów poniżej granicy wykrywalności użytego testu. To samo może dotyczyć wykrywania swoistych przeciwciał. Wykorzystywany test może uwzględniać identyfikację wyłącznie określonej grupy szczepów danego gatunku drobnoustroju. Dla przykładu ma to miejsce w diagnostyce serologicznej pleuropneumonii. W tym przypadku dostępne są testy serologiczne pozwalające na wykrycie poszczególnych serotypów App. Zastosowanie testu przeznaczonego do wykrywania serotypu 13 nie pozwoli na wykrycie serotypu 5 App. Warunki, w których pobierano, przesyłano lub przetrzymywano próbki do badań też mogą odegrać istotną rolę w formułowaniu błędnych wyników. Przykładowo, niewłaściwe pobranie próbki, wysoka temperatura, w której ją transportowano do laboratorium, zbyt długi czas od pobrania do wykonania próby mogą mieć znaczenie decydujące.

Identyfikacja ważnych diagnostycznie odcinków DNA możliwa jest nawet po bardzo długim okresie od pobrania próbek. Jednakże fałszywie negatywne wyniki w przypadku próbek z kału, przy zastosowaniu PCR, w kierunku różnych jelitowych patogenów, mogą być uzyskane bezpośrednio po pobraniu materiału do badań. Przyczyną fałszywie ujemnych wyników PCR mogą być w tym przypadku hamujące substancje występujące w kale. Fałszywie ujemne wyniki infekcji bakteryjnych mogą występować, jeśli materiał biologiczny pobrano od świń leczonych antybiotykami. W przypadku badań bakteriologicznych zdarza się to także, gdy próbki z różnych powodów poddano procesowi sterylizacji.

            Najczęstszą przyczyną wyników fałszywie ujemnych są błędy popełniane w trakcie pobierania próbek (źle pobrane wymazy z nosa, zbyt późno pobrane próbki od padłych zwierząt, wybór niewłaściwych osobników do próbkobrania itp.). Przede wszystkim pracownicy laboratoriów, ale także lekarze praktycy powinni zdawać sobie sprawę, że pomimo wielu zabezpieczeń mogą zdarzyć się „seryjne” fałszywie dodatnie wyniki w teście PCR. Problem ten pojawia się wtedy, gdy dojdzie do kontaminacji (zanieczyszczenia laboratorium) materiałem genetycznym (DNA), który poszukujemy.

Warto pamiętać, że wyniki badań laboratoryjnych mogą być ważnym dowodem niewystępowania lub eradykacji danego czynnika chorobotwórczego ze stada.

Podsumowanie

W podsumowaniu warto podkreślić, że warunkami determinującymi przydatność badań laboratoryjnych w praktyce jest wysoka kompetencja wykonujących badania specjalistów, właściwe wyposażenie laboratoriów oraz profesjonalizm zlecających badania lekarzy praktyków czy też lekarzy weterynarii z inspekcji weterynaryjnej. Należy mieć świadomość, że tak jak to ma miejsce w każdej dziedzinie, także w odniesieniu do laboratoriów zasadne jest korzystanie z tych, które cieszą się szczególnym zaufaniem, na które pracuje się latami.